ibidi提供了一個(gè)簡單經(jīng)濟(jì)高效的方案，使用可移除的12孔腔室載玻片進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，固定和染色。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞并用formalin溶液固定。細(xì)胞核用DAPI和肌動(dòng)蛋白骨架用DYE-490鬼筆環(huán)肽染色。可以使用一抗和二抗染色通過免疫細(xì)胞化學(xué)探測(cè)其他細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。

德國ibidi 81201載玻片

實(shí)驗(yàn)使用的材料和試劑列于下面。

• 12孔腔室載玻片，可移除（ibidi，81201）

• 用于腔室的蓋玻片，可移除，24mm x 60 mm（ibidi，10811）

• 細(xì)胞：MCF-7（CLS，300273）

• 細(xì)胞培養(yǎng)基

• 細(xì)胞培養(yǎng)試劑

• 聚苯硫醚

• formalin溶液中性緩沖液，10％（Sigma，HT5011）

• 染色試劑

o  DAPI（Sigma，D954）

o  DYE-490鬼筆環(huán)肽（Dynomics，490-33）

• 安裝介質(zhì)：FluoroshieldTm值（Sigma，F(xiàn)6182）

實(shí)驗(yàn)方案：

步驟1：

必須在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類型，用2-6x10 4細(xì)胞/ ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層。
1.打開12孔可移除腔室載玻片（ibidi，81201）包裝，在無菌條件下可拆除。
2.像往常一樣用胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞濃度為5×104細(xì)胞/ ml MCF-7。
3. 將250μl細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個(gè)孔中。避免搖晃，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。
4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO2下培養(yǎng)。細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時(shí)，或直到建立融合的單層

步驟2：

固定是染色程序的第一步。目標(biāo)是將細(xì)胞，細(xì)胞形成物或組織維持在其當(dāng)前狀態(tài)，并在較長時(shí)間內(nèi)通過化學(xué)試劑保存。
1.小心地吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。
2.用PBS洗兩次。
3.加入250μl的formalin溶液。
4.在室溫下孵育30分鐘。
5.小心吸入formalin溶液。
6.用PBS洗滌三次。

步驟3：

應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白骨架。
1.準(zhǔn)備你的染色溶液：· 聚苯硫醚· DYE-490鬼筆環(huán)肽· DAPI 1µg/ml
2.小心吸出PBS。
3.移取250μl染色溶液到每個(gè)孔中
4.在室溫下避光孵育30分鐘

步驟4：

在染色后清洗你的樣本會(huì)使背景信號(hào)降到很低   
1.小心地吸出染色溶液 
2.加入250μl緩沖液     
3.小心吸入緩沖液   
4.重復(fù)步驟2和步驟3一次

步驟5：

從一個(gè)邊部開始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢，穩(wěn)定的進(jìn)行，以避免損壞細(xì)胞層。

步驟6：

完成染色程序后，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還防止樣品脫水。
1.將載玻片側(cè)面在干凈的實(shí)驗(yàn)室濕巾上輕敲，從樣品中去除多余的介質(zhì)。
2.將封固劑涂在樣品上。用24毫米x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝的樣品，小心地將蓋玻片放到安裝介質(zhì)上，以避免夾住任何氣泡。推薦使用諸如FluoroshieldTm值（Sigma-Aldrich），Vectashield®（Vector Laboratories Inc.）或ProLongAntifade®（ThermoFisher Scientific）的硬化封固劑。
3.安裝封固劑固化。

步驟7：顯微觀察

使用12孔可移除載玻片培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，用DAPI和DYE 490鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞結(jié)構(gòu)。使用硬化封固劑安裝載玻片保存樣品以便長期儲(chǔ)存。
圖1用DYE490鬼筆環(huán)肽（左上）染色MCF-7細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白骨架，并用DAPI（右上）染色細(xì)胞核。下圖顯示了合成圖像，其中細(xì)胞核為藍(lán)色，肌動(dòng)蛋白骨骼為綠色。（比例尺：100μm）